作者：Lauri Nikkanen, Anita Santana Sánchez, Maria Ermakova, Matthias R?gner, Laurent Cournac, Yagut Allahverdiyeva

時(shí)間：2020年1月9日

雜志：BioRxiv生物學(xué)預(yù)印本

標(biāo)題：Functional redundancy and crosstalk between flavodiiron proteins and NDH-1 in Synechocystis sp. PCC 6803

研究背景：

光合生物具有不同的調(diào)控機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境條件快速變化，以保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免于損傷。波動(dòng)光強(qiáng)可能會(huì)導(dǎo)致光合電子傳遞鏈（PETC），特別是光系統(tǒng)（PSI）的過(guò)度還原，從而給光系統(tǒng)帶來(lái)?yè)p傷風(fēng)險(xiǎn)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，藍(lán)細(xì)菌、藻類(lèi)和植物（不包括被子植物）使用C型黃酮二鐵蛋白（FDP）作為強(qiáng)大的光保護(hù)電子庫(kù)，將多余的光合電子從PSI下游引導(dǎo)至O2。該過(guò)程稱(chēng)為類(lèi)似Mehler的反應(yīng)，但與Mehler反應(yīng)相反，它不會(huì)產(chǎn)生有害的活性氧（ROS）。

β-藍(lán)藻（集胞藻屬PCC 6803，下文簡(jiǎn)稱(chēng)集胞藻）的基因組，編碼四種FDP亞型，即Flv1-4，它們以Flv1和Flv3或Flv2和Flv4組成的雜合低聚物在O2光還原中起主要的作用。本文作者之前的研究表明，在空氣CO2水平下，F(xiàn)lv1/3和Flv2/4雜聚物以協(xié)調(diào)和相互依賴(lài)的方式起作用：Flv1/3在照光開(kāi)始時(shí)或在光強(qiáng)變強(qiáng)時(shí)刺激強(qiáng)烈的但短暫的O2光還原。Flv2/4雜聚物催化O2的穩(wěn)態(tài)還原，速率緩慢且催化能力弱，但也可以消耗PSI下游的電子。在堿性條件下（pH為9）的高濃度CO2和空氣CO2濃度中，編碼Flv2，F(xiàn)lv4和Sll0218蛋白的flv4-flv2操縱子被下調(diào)。盡管如此，在高濃度的CO2中，F(xiàn)lv1/3的低水平會(huì)刺激強(qiáng)烈的穩(wěn)態(tài)O2光還原，而在pH為9的空氣CO2中，F(xiàn)lv1/3只負(fù)責(zé)強(qiáng)烈但短暫的O2光還原。體外實(shí)驗(yàn)表明重組Flv1，F(xiàn)lv3和Flv4的同型寡聚體可以通過(guò)NADH和/或NADPH還原O2，但FNR和還原態(tài)Fd是否是FDP的可能供體，尚未被證明。此外，與體外實(shí)驗(yàn)相反，單獨(dú)過(guò)表達(dá)Flv1或Flv3的集胞藻突變體的研究清楚地表明， Flv3或Flv1的同型低聚物不參與體內(nèi)O2的光還原。因此，體內(nèi)FDPs的電子供體仍有待闡明。

在藍(lán)藻中，光合作用和呼吸電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)共存于類(lèi)囊體膜上，并且相互錯(cuò)綜復(fù)雜地聯(lián)系在一起，需要進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控。NAD(P)H脫氫酶復(fù)合物1（NDH-1，光合復(fù)合物I）主要分布于類(lèi)囊體膜中，參與多種生物能量反應(yīng)，包括PSI周?chē)难h(huán)電子傳遞（CET），呼吸和通過(guò)碳濃縮機(jī)制(CCM)獲得CO2。NDH-1復(fù)合物以幾種形式存在，具有不同的生理作用：NDH-11型以NDHD1和NDHF1亞基為特征，并作為呼吸電子傳遞鏈的復(fù)合物I發(fā)揮功能；NDH-12則為NdhD2亞基，目前尚不清楚NDH-11和NDH-12是否具有不同的生理功能。NDH-13和NDH-14形式分別包括低Ci誘導(dǎo)的高親和力CO2獲取亞基NdhD3、NdhF3、CuPA和CUPS，或分別構(gòu)成的低親和力CO2獲取亞基NdhD4、NdhF4和CuPB，在CO2到HCO3-(O)的轉(zhuǎn)化中起作用。這一過(guò)程可能是由NDH-1質(zhì)子泵在類(lèi)囊體膜上產(chǎn)生堿性口袋實(shí)現(xiàn)的。所有四種NDH-1類(lèi)型都催化CET從鐵氧還蛋白(FD)到質(zhì)體醌(PQ)，這與4H+/2e-泵入類(lèi)囊體腔有關(guān)。然而，對(duì)于NDH-13,4，功能要弱于NDH-11,2。

在本研究中，我們旨在闡明FDPS和NDH-1介導(dǎo)的電子傳遞通路如何在可變光照和Ci-濃度變化下，在Calvin-Benson-Bassham循環(huán)(CBB)中協(xié)同維持PETC、呼吸、CCM和CO2固定之間的氧化還原平衡。為此，我們采用生物物理和生物化學(xué)方法對(duì)同時(shí)存在FDP和NDH-1途徑缺陷的集胞藻突變株進(jìn)行了研究。我們的結(jié)果為Flv1/3或NDH-11,2的存在提供了令人信服的證據(jù)，但不是NDH-13,4，需要說(shuō)明的是NDH-13,4對(duì)于集胞藻在從高濃度CO2條件過(guò)渡到空氣CO2和強(qiáng)光的聯(lián)合脅迫條件下的生存是必不可少的。我們證明Flv1/3和NDH-11,2的動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)和協(xié)同作用是集胞藻細(xì)胞光合結(jié)構(gòu)光保護(hù)所必需的，并討論了其中涉及的分子機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

使用了耐葡萄糖的野生Synechocystis sp PCC 6803，單突變株Δflv1和Δflv3, M55突變株（ΔndhB）, 雙突變體Δd1d2和Δd3d4和三突變體Δflv1d1d2, Δflv3d1d2, Δflv1d3d4和Δflv3d3d4。所有突變體均顯示出完全分離。實(shí)驗(yàn)前的培養(yǎng)物以30ml分批培養(yǎng)在pH 7.5的BG-11培養(yǎng)基中，其他培養(yǎng)條件CO2為3％，溫度30℃，中等光強(qiáng)（ML）50 μmolm-2s-1連續(xù)白光。突變的預(yù)培養(yǎng)物補(bǔ)充有適當(dāng)?shù)目股亍Ｔ趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞收獲并重懸于新鮮的不含抗生素的BG-11中，OD750為0.1–0.2。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到空氣[CO2] / 30℃，并用50或220μmolm-2s-1的白光連續(xù)照射。

測(cè)量參數(shù)：

氣體交換，熒光和差示吸收（Y(ND), Y(NA), Y(I)），近紅外光譜吸收，77K熒光，NADPH，ECS, 蛋白質(zhì)提取及免疫印跡, 波動(dòng)光響應(yīng)。

使用儀器：

DUAL-PAM-100，DUAL-KLAS-NIR,  9-AA/NADPH等

部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

通過(guò)對(duì)單個(gè)FDP突變體（Δflv1和Δflv3）和雙重NDH-1突變體（Δd1d2，其中NDH-11,2和Δd3d4缺乏，NDH-13,4），以及三重突變體（缺少Flv1或Flv3以及NDH-11,2或NDH-13,4之一）的研究表明，F(xiàn)lv1 / 3或NDH-11,2的存在對(duì)于生長(zhǎng)條件從高CO2 /中等光照到低CO2 /高光照變化的生存是必不可少的。另外，在研究條件下，F(xiàn)DP和NDH-11,2之間存在功能冗余和串?dāng)_，并表明FDP和NDH-11,2的功能是動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)的，以有效地氧化PSI，并在可變的CO2和波動(dòng)光下進(jìn)行光保護(hù)。

圖1 WT和突變體在不同實(shí)驗(yàn)條件下的生長(zhǎng)情況

所有的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)都是從預(yù)培養(yǎng)開(kāi)始，調(diào)整到OD750=0.1。(A)細(xì)胞在3%[CO2]/中等光照(ML 50μmolm-2s-1)中預(yù)培養(yǎng)，調(diào)節(jié)OD750=0.1，在相同條件下生長(zhǎng)。(B)細(xì)胞在3%[CO2]/中等光照下預(yù)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到空氣[CO2]/中等光照中。(C)細(xì)胞在空氣[CO2]/ML中預(yù)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到空氣[CO2]/高光照中(HL 220μmolm-2s-1)。(D)細(xì)胞在3%[CO2]/ 中等光照下預(yù)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到空氣[CO2]/ 高光照中。A-D中顯示的值是三個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)±SE的平均值。(E)WT細(xì)胞和突變細(xì)胞在含有BG-11的瓊脂平板上生長(zhǎng)的結(jié)果。收集生長(zhǎng)在3%[CO2]/ML下的細(xì)胞，以10倍梯度稀釋后點(diǎn)到BG-11瓊脂平板上，從OD750=1開(kāi)始，分別在空氣[CO2]/ML和空氣[CO2]/HL下孵育7d。更多結(jié)果參考補(bǔ)充數(shù)據(jù)S1.

圖2 WT和突變體的O2和CO2交換率

細(xì)胞在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)4天后收獲細(xì)胞，用新鮮的BG-11調(diào)節(jié)Chla濃度至10μg·ml-1。暗適應(yīng)15min，用500μmolm-2s-1的白光照射5min，用膜進(jìn)樣質(zhì)譜計(jì)監(jiān)測(cè)氣體交換情況。在測(cè)量之前，樣品添加了與16O2濃度相同的18O2，以區(qū)分O2的攝取和放氧，并添加了1.5 mM的NaHCO3。每組的虛線(xiàn)表示CO2固定的補(bǔ)償點(diǎn)(攝取速率等于呼吸速率)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了三個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)，給出了具有代表性的測(cè)量結(jié)果。

圖3 WT和突變體在不同光強(qiáng)下的光合參數(shù)

(A) PSI的受體側(cè)限，Y(NA)，(B)PSI的供體側(cè)限，Y(ND)，以及(C)PSI的有效產(chǎn)率，Y(I)根據(jù)在875-830 nm處的差示吸收變化計(jì)算。葉綠素a熒光變化與PSI氧化還原變化同步測(cè)量，用于計(jì)算(D)PSII的有效產(chǎn)率。細(xì)胞在空氣中培養(yǎng)4d后收獲細(xì)胞，用新鮮BG-11調(diào)節(jié)Chla濃度至10μg ml-1。將細(xì)胞暗適應(yīng)10min，然后用紅色光化光強(qiáng)度在25和530μmolm-2s-1之間交替照射1min。每15秒提供飽和脈沖(Width: 500ms, Int.: 5000μmolm-2s-1)。所顯示的值是3-4個(gè)獨(dú)立生物重復(fù)±SE的平均值。

圖4 WT和突變體在波動(dòng)光下的NADPH和Chl a熒光

WT(A)、Δflv3(B)、Δd1d2(C)和Δflv3 d1d2細(xì)胞(D)在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)4d后，收集細(xì)胞，用新鮮BG-11調(diào)節(jié)Chla濃度至5μg ml-1。暗適應(yīng)10min后，用25/530μmolm-2s-1的交替紅光照射1min。用Dual-PAM 100雙通道葉綠素?zé)晒鈨x及其9-AA/NADPH附件模塊監(jiān)測(cè)NADPH氧化還原變化，方法是測(cè)量365 nm激發(fā)引起的420至580 nm之間的熒光變化。同時(shí)記錄葉綠素a熒光。(E)暗適應(yīng)細(xì)胞在530μmolm-2s-1照射過(guò)程中，NADPH氧化還原發(fā)生變化。其他實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)如A-D所示。(F)顯示(E)中照明的前2秒的放大結(jié)果。這些值分別根據(jù)在照明開(kāi)始和停止時(shí)的最小和最大熒光變化來(lái)歸一化。用三個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，其中顯示了具有代表性的測(cè)量結(jié)果。RU。=相對(duì)單位。

圖5 黑暗到HL轉(zhuǎn)變過(guò)程中PC、P700和FD的氧化還原變化，以及pmf的建立

將wt(A)、Δflv3(B)、Δd1d2(C)和Δflv3 d1d2(D)暗適應(yīng)10min，然后用DUAL-KLAS-NIR四通道近紅外光譜儀測(cè)量在503μmolm-2s-1紅光照射30s期間，在780-800 nm，820-870 nm，840-965 nm和870-965 nm處吸光度的差異變化。使用為本研究確定的差分模型曲線(xiàn)圖(DMPS)將PC、P700和Fd信號(hào)從吸光度差異變化中去卷積(圖S3)。A-D中的上圖顯示了下圖前1.5秒照光過(guò)程的放大結(jié)果。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了三個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)，其中顯示了具有代表性的測(cè)量結(jié)果。另請(qǐng)參閱補(bǔ)充圖S3。(E)從暗到500μmolm-2s-1的綠色光化光的過(guò)渡過(guò)程中pmf的積累。用JTS-10型光譜儀測(cè)量了500-480 nm(ECS)的吸光度差，根據(jù)ECS信號(hào)的暗間隔弛豫動(dòng)力學(xué)(DIRK)測(cè)定了光誘導(dǎo)的pmf。給出了3-4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。小插圖顯示照明1s后的pmf值，以獲得更清晰的視圖。(F) 如(E)，在光照1s和30s后的類(lèi)囊體膜質(zhì)子導(dǎo)度(gH+)。gH+是通過(guò)ECS信號(hào)在第一次光照后衰減動(dòng)力學(xué)時(shí)間常數(shù)的倒數(shù)來(lái)計(jì)算的。(G)類(lèi)囊體質(zhì)子通量(vH+)，以pmf×gH+計(jì)算。(H)500-480 nm吸光度差的代表性結(jié)果，用于測(cè)量E中的結(jié)果以及在光照30秒后的500 ms暗間隔期間ECS衰減動(dòng)力學(xué)的值(下圖)。擬合曲線(xiàn)顯示為綠色。在空氣[CO2]/ML中生長(zhǎng)4d后收獲細(xì)胞，用新鮮BG-11調(diào)節(jié)Chla濃度至10 μg ml-1(A-D)，7.5μg ml-1(E-J)。

圖6 WT和突變體光合作用和CCM相關(guān)蛋白的免疫印跡檢測(cè)和77K熒光發(fā)射光譜

預(yù)培養(yǎng)在3%[CO2]/ML下培養(yǎng)3天，然后收獲，再懸浮在OD750=0.15新鮮的BG-11中，(A)在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)24小時(shí)，(B)在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)4天，收獲后再懸浮在OD750=0.15的BG-11中，然后在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)24小時(shí)。(C)在空氣[CO2]/HL中孵育24小時(shí)。用SDS-PAGE分離總蛋白提取物，并用特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。所示的免疫印跡代表2-3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。(D)完整的WT和ΔFlv3d1d2細(xì)胞在空氣[CO2]/ML中生長(zhǎng)4天的77K熒光發(fā)射光譜。(E)在3%[CO2]/ML中預(yù)培養(yǎng)生長(zhǎng)后收獲，再懸浮在OD750=0.15的新鮮BG-11中，在空氣[CO2]/HL中孵育24小時(shí)。將細(xì)胞(D和E)收獲，調(diào)節(jié)到Chla為7.5μg ml-1，在77K用440 nm光激發(fā)。將光譜歸一化為685 nm處的PSII熒光峰。

圖7 協(xié)調(diào)FDPs和NDH-1的活性以防止PSI過(guò)度還原的模型示意圖

(A)在Fd庫(kù)大量還原而PQ庫(kù)沒(méi)有還原的條件下，NDH-1L將電子從Fd轉(zhuǎn)移到PQ池，同時(shí)通過(guò)類(lèi)囊體局部RTOs還原O2。NDH-1L將2H+/e-泵入管腔，而FDP和RTO在類(lèi)囊體液面將O2還原為H2O時(shí)消耗H+。這增加了跨類(lèi)囊體pmf，而pmf反過(guò)來(lái)推動(dòng)ATP合成，抑制Cytb6f處的PQH2氧化，從而防止進(jìn)一步向PSI提供過(guò)多的電子。NDH1-MS的碳酸酐酶活性將HCO3-轉(zhuǎn)化為CO2，消耗胞質(zhì)中的H+，可能還耦合了H+到管腔的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)一步增加了pmf。CO2利用率和ATP/NADPH比值的增加提高了CBB在PETC受體側(cè)的電子吸收能力。(B)如果PQ庫(kù)被高度還原，F(xiàn)d庫(kù)被氧化，并且pmf很高，則假設(shè)NDH-1L可以起相反的作用，通過(guò)從管腔釋放2H+/e-來(lái)將電子從PQH2轉(zhuǎn)移到Fd+。由Flv1/3催化的強(qiáng)Mehler式反應(yīng)在此時(shí)就非常有必要，以維持足夠的氧化態(tài)Fd庫(kù)，F(xiàn)lv1/3可能直接接受來(lái)自Fd-的電子。(A)中所述的大部分成分在(B)中被省略，以提高清晰度，而不是暗示它們不存在。PQ/PQH2和Fd的顏色填充范圍表示還原的水平。

由于相關(guān)研究?jī)?nèi)容非常專(zhuān)業(yè)，難免有些理解不準(zhǔn)確或者編輯整理的疏漏，請(qǐng)以英文原文為準(zhǔn)。

Nikkanen L E, Sanchez A I S, Ermakova M, et al. Functional redundancy and crosstalk between flavodiiron proteins and NDH-1 in Synechocystis sp. PCC 6803. bioRxiv, 2020: 2019.12. 23.886929.