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Ampha Z32花粉活力分析儀在DH育種中的應(yīng)用
日期:2021-04-15 16:01:43

雙單倍體(Doubled Haploid)育種,簡(jiǎn)稱DH育種,是利用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)(或花藥離體培養(yǎng)等手段誘導(dǎo))產(chǎn)生單倍體植株,再通過(guò)染色體組加倍(自然加倍或藥劑處理)使植物恢復(fù)正常染色體數(shù)的育種方法。DH育種能夠在較短時(shí)間(2代)內(nèi)便可以選育出DH純系,大大縮短育種年限,是加速種質(zhì)材料純化、縮短育種年限的有效途徑,是現(xiàn)代生物技術(shù)育種的主要支柱技術(shù)之一。


由于自然單性生殖或孤雄生殖單倍體非常罕見(jiàn),因此單倍體的獲得成為單倍體育種的一個(gè)難點(diǎn),游離小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體的重要手段之一。植物游離小孢子培養(yǎng)受外植體預(yù)處理、小孢子預(yù)處理、供體基因型、小孢子培養(yǎng)密度、培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)基成分等因素的共同影響,因此無(wú)法形成通用的誘導(dǎo)策略,需要從花芽選取、小孢子胚誘導(dǎo)、二倍體化等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行不斷的調(diào)整和改善,才能構(gòu)建一種植物優(yōu)選的游離小孢子培養(yǎng)體系。


本文利用Ampha Z32花粉活力分析儀(阻抗流式細(xì)胞技術(shù),IFC)進(jìn)行了系列測(cè)試,以期幫助廣大科研用戶構(gòu)建優(yōu)選的游離小孢子培養(yǎng)體系,提高游離小孢子的培養(yǎng)效率:1)確定小孢子各發(fā)育階段的相位角-振幅散點(diǎn)圖,并歸納發(fā)育變化軌跡;2)確定培養(yǎng)開(kāi)始前和整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中小孢子的活力;3)估算小孢子的密度;4)監(jiān)測(cè)小孢子對(duì)誘導(dǎo)策略和培養(yǎng)條件的響應(yīng),進(jìn)行產(chǎn)胚率的早期預(yù)測(cè)。


—— 小孢子發(fā)育階段 ——


小孢子發(fā)育時(shí)期是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一,選擇合適的花粉發(fā)育時(shí)期可極大的提高植株小孢子胚狀體發(fā)生的誘導(dǎo)效率。大量研究表明,通常小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核晚期(單核靠邊期)和雙核早期,這可能是由于單核靠邊期的小孢子處于面臨不同分裂方式和發(fā)育途徑的敏感時(shí)期,更容易誘導(dǎo)成功。因此,準(zhǔn)確判斷并選擇最適時(shí)期的小孢子進(jìn)行培養(yǎng),是提高產(chǎn)胚量的基本保障。


傳統(tǒng)上進(jìn)行小孢子發(fā)育階段的鑒定是通過(guò)染色鏡檢法,即用DAPI或乙酰胭脂紅對(duì)采自不同大小花蕾或穗的小孢子進(jìn)行染色,然后顯微鏡觀察細(xì)胞核的數(shù)目和形態(tài),并計(jì)數(shù)以確定各發(fā)育階段細(xì)胞所占的比例,此過(guò)程極其費(fèi)時(shí)、耗力。


由于處于不同發(fā)育階段的小孢子的體積、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的特性不同,Ampha Z32花粉活力分析儀所檢測(cè)到的電阻抗信號(hào)也就不同,由此而生成的相位角(X-相對(duì)活性)-振幅(Y-相對(duì)大?。┥Ⅻc(diǎn)圖不同,所形成的散點(diǎn)類群也不同。如圖1所示,小麥孢子發(fā)育過(guò)程散點(diǎn)圖的變化以及DAPI染色法確定的對(duì)應(yīng)發(fā)育階段。本測(cè)試使用AF6緩沖液從單個(gè)小穗的花藥中分離出小孢子,取極小的一部分進(jìn)行DAPI染色,剩余部分經(jīng)過(guò)濾稀釋后用Ampha Z32花粉活力分析儀進(jìn)行測(cè)量


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圖1 小麥孢子發(fā)育變化軌跡


我們測(cè)試了多種植物在不同發(fā)育階段的散點(diǎn)云圖,并對(duì)比了不同發(fā)育階段散點(diǎn)云變化,結(jié)果表明通過(guò)散點(diǎn)圖的變化軌跡均可以準(zhǔn)確區(qū)分出小孢子的不同發(fā)育階段。如圖2所示,不同發(fā)育階段的散點(diǎn)顏色不同,三細(xì)胞花粉物種(西藍(lán)花、辣椒)成熟軌跡中的散點(diǎn)類群明顯多于二細(xì)胞花粉物種(水稻)。利用Ampha Soft軟件的統(tǒng)計(jì)分析功能,我們可以量化每個(gè)顏色類群的散點(diǎn)數(shù),即統(tǒng)計(jì)出每個(gè)發(fā)育階段的小孢子的數(shù)量及比例,幫助確定特定發(fā)育階段占比較高的花芽的大小或小穗所處的位置,如圖3所示。小孢子發(fā)育階段的準(zhǔn)確判定,為小孢子供體的選擇帶來(lái)極大的便利,可極大的提高植株小孢子胚狀體發(fā)生的誘導(dǎo)頻率。


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圖2 小孢子不同發(fā)育階段的散點(diǎn)云疊加圖

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圖3 麥穗不同穗位的單核、雙核和三核小孢子的比例


盡管同一物種的花粉在發(fā)育的單核早期、單核晚期及成熟早期的相位角-振幅散點(diǎn)圖中具有相似的相位角,但振幅大小卻可能差異顯著,這是由于遺傳變異會(huì)影響小孢子的大小,因此我們建議根據(jù)基因型評(píng)估不同花粉的發(fā)育階段。

 

—— 小孢子的活力和密度 ——


小孢子的活力和密度亦是影響小孢子胚狀體產(chǎn)生的主要因素。本實(shí)驗(yàn)利用Ampha Z32花粉活力分析儀對(duì)這兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)試,同時(shí)利用FDA染色法測(cè)試細(xì)胞活力,利用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。


Ampha Z32花粉活力分析儀(Amphasys,瑞士),通過(guò)檢測(cè)流經(jīng)交流電場(chǎng)的花粉懸浮液中花粉的電阻抗信號(hào),分析獲得花粉的數(shù)量、大小、活性,測(cè)量過(guò)程中確保懸浮液介質(zhì)電導(dǎo)率的穩(wěn)定對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估花粉活性是非常重要的。大量實(shí)驗(yàn)表明,緩沖液(AmphaFluid)體積占比達(dá)到50-80%,才能較好的評(píng)估小孢子的活性,由于不同培養(yǎng)介質(zhì)的電導(dǎo)率不同,建議通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)確定小孢子培養(yǎng)液和緩沖液(AmphaFluid)的較優(yōu)體積比。移取精確體積的小孢子混合液后,在Ampha Z32花粉活力分析儀的計(jì)數(shù)模式下進(jìn)行測(cè)量即可確定小孢子的準(zhǔn)確濃度,并統(tǒng)計(jì)出活性小孢子的數(shù)量,整個(gè)測(cè)試過(guò)程不超過(guò)2min


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圖4 南瓜小孢子散點(diǎn)圖


—— 誘導(dǎo)成功率評(píng)估及產(chǎn)胚量的早期預(yù)測(cè) ——


法國(guó)Vegenov研究所利用AmphaZ32花粉活力分析儀追蹤了小麥小孢子的發(fā)育過(guò)程(案例介紹Ampha Z32在小麥孢子發(fā)育及產(chǎn)胚量早期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)誘導(dǎo)處理后,大部分小麥小孢子在培養(yǎng)的幾天內(nèi)就停止了發(fā)育,只有一小部分活細(xì)胞能逐漸分裂成星形小孢子,最后形成有組織結(jié)構(gòu)的胚狀體。


Vegenov的研究發(fā)現(xiàn),IFC信號(hào)隨小麥小孢子形態(tài)、細(xì)胞大小的變化而變化,結(jié)合顯微鏡鏡檢(圖5),可以準(zhǔn)確匹配到小孢子發(fā)育的不同階段。從IFC信號(hào)所確定的相位角-振幅散點(diǎn)圖中可利用多邊形門(mén)控區(qū)分出處于不同發(fā)育狀態(tài)的小孢子類群,如圖6所示。其中小孢子經(jīng)過(guò)脅迫處理后(D0),相位角-振幅散點(diǎn)圖中出現(xiàn)的P2細(xì)胞類群為具有活性的小孢子群,后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明,這一類群反映了小麥小孢子對(duì)誘導(dǎo)處理的響應(yīng),可幫助在小孢子培養(yǎng)前確定誘導(dǎo)處理的效果,提高胚狀體發(fā)生的成功率。而培養(yǎng)開(kāi)始后出現(xiàn)的P3細(xì)胞類群,與花粉發(fā)育(配子體發(fā)育途徑)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的任何細(xì)胞類群都不重疊,這表明該類群是孢子體發(fā)育途徑中特有的細(xì)胞類群。培養(yǎng)過(guò)程中,該類群細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,振幅和相位逐漸增大,說(shuō)明部分小孢子在這一過(guò)程中死亡,而部分小孢子胚在不斷生長(zhǎng)發(fā)育。此外,本實(shí)驗(yàn)還以IFC測(cè)試數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),建立了預(yù)測(cè)胚胎產(chǎn)量的線性數(shù)學(xué)模型,統(tǒng)計(jì)分析表明,培養(yǎng)第7天P3類群的細(xì)胞數(shù)量可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)30d后的胚胎產(chǎn)量(y=6.539x-20.827;R^2=0.9519,p <0.05)。


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圖5 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段

(A)單核小孢子;(B)雙核小孢子;(C)花粉粒;(D)星形小孢子(v為液泡);(E)多核小孢子;(F)質(zhì)膜化小孢子

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圖6 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段(IFC法)

配子體途徑:ML:?jiǎn)魏酥型砥?;EB:早期雙核;LB:?jiǎn)魏送砥?;ET:三核早期;LT:三核晚期。孢子體途徑:培養(yǎng)前21天、培養(yǎng)第0、1、5和7天的小孢子發(fā)育狀態(tài)。ML/D-21代表配子體發(fā)育和孢子體發(fā)育的共同階段,紅色垂直門(mén)控右側(cè)為活性細(xì)胞,藍(lán)色多邊形門(mén)控P1為雄核發(fā)育開(kāi)始時(shí)的活性孢子群;綠色多邊形門(mén)控P2為脅迫處理后,孢子離體培養(yǎng)前(D0)的活性孢子群;紫色多邊形門(mén)控P3為離體培養(yǎng)1天后的活性孢子群。

 

以上結(jié)果表明,IFC法可以在DH育種過(guò)程中,幫助選擇小孢子植物供體,評(píng)估小孢子胚誘導(dǎo)策略,優(yōu)化培養(yǎng)條件,并在小孢子培養(yǎng)早期進(jìn)行產(chǎn)胚量的準(zhǔn)確預(yù)測(cè),可顯著提高游離小孢子培養(yǎng)的成功率,進(jìn)而加快DH育種的效率。


原文閱讀:Accelerating Doubled Haploid Plant Production


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