海洋微生物無(wú)處不在，通過(guò)光合作用和生物地球化學(xué)循環(huán)等關(guān)鍵過(guò)程，在海洋中發(fā)揮著基本作用。由于其很高的更替頻率和不完整的分布，監(jiān)測(cè)時(shí)需要在正確的時(shí)間和空間取樣。使用兩個(gè)在線流式細(xì)胞儀系統(tǒng)對(duì)那不勒斯灣沿岸地區(qū)的海洋微生物進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，驗(yàn)證一種新的概念，證明該技術(shù)可以作為一個(gè)實(shí)時(shí)水質(zhì)報(bào)警系統(tǒng)的有用工具。建議將細(xì)菌和微型浮游植物濃度作為水質(zhì)的一般指標(biāo)，這是評(píng)估環(huán)境條件變化的影響所必需的第一步，隨后將深入分析群落組成是否存在病原體或其他指標(biāo)。在調(diào)查期間，我們發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)處理的城市廢物排放區(qū)或河流輸入?yún)^(qū)細(xì)菌濃度高。一般說(shuō)來(lái)，細(xì)菌的豐度與鹽度呈負(fù)相關(guān)，這表明它們利用陸地來(lái)源的有機(jī)物進(jìn)行生長(zhǎng)。所使用的技術(shù)方法也是根據(jù)旨在評(píng)估和改善歐洲海洋水域質(zhì)量的歐洲指令2008/56/EC，是監(jiān)測(cè)沿海地區(qū)的一種有用和快速的方法。海洋微生物具有高度的動(dòng)態(tài)性，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)性質(zhì)的變化反應(yīng)非常快，從而導(dǎo)致急性污染事件為了捕捉這些反應(yīng)并確定其原因，需要高頻準(zhǔn)確的測(cè)量。大多數(shù)用于監(jiān)測(cè)海洋微生物的方法都存在重復(fù)性低、響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)和對(duì)勞動(dòng)力要求高的問(wèn)題。流式細(xì)胞術(shù)提供了一個(gè)解決這些限制的方法，允許快速、準(zhǔn)確和可復(fù)制的海洋微生物計(jì)數(shù)，并在海洋生態(tài)學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)是一種利用散射和熒光來(lái)鑒別和計(jì)數(shù)細(xì)胞類型的非軸測(cè)、基于單細(xì)胞的方法。由于光合色素的自熒光性，光合微生物可以直接分析，而非自熒光微生物（如異養(yǎng)細(xì)菌）則需要在分析前進(jìn)行染色。染色步驟需要樣品處理和孵育時(shí)間，這是正確評(píng)估細(xì)胞濃度所必需的。在環(huán)境科學(xué)中，自動(dòng)流式細(xì)胞術(shù)已用于自發(fā)熒光微生物和染色后的異養(yǎng)細(xì)菌。我們將這兩種方法結(jié)合起來(lái)，分別使用了用于在線分析光營(yíng)養(yǎng)微生物的Cytosense（CytoBuoy BV）和連接到海洋航行船的泵的OnCyt自動(dòng)流式細(xì)胞儀（OnCyt Microbiology AG）。證明了高空間分辨率監(jiān)測(cè)表面微生物分布是可行的，并提供了有用的第一手信息，可用于快速和實(shí)時(shí)地指示水質(zhì)。2017年6月19日在RV Vettoria上采樣。地表水由船泵通過(guò)在線熱鹽計(jì) (SBE45 MicroThermalSalinograph，Seabird Electronics)，測(cè)量溫度和鹽度，并通過(guò)在線熒光計(jì)測(cè)量總熒光(CycloPS7，Turner Design 連接databank）。然后，水流過(guò)采樣裝置（Cytobuy BV)，并依次通過(guò)Cytosense流式細(xì)胞儀（Cytobuy BV）和OnCyt在線流式細(xì)胞儀。
Cytosense每2分鐘分析一次樣品，而OnCyt每13分鐘（取決于染色時(shí)間）分析一次樣品，對(duì)應(yīng)每1km 采樣一次，取決于船速。常規(guī)流式細(xì)胞儀分析的離散樣本每10分鐘在表面采集一次，以驗(yàn)證onCyt計(jì)數(shù)。在，將這些樣品固定、冷凍并稍后在實(shí)驗(yàn)室用SYBRGreen染色后進(jìn)行分析。從CytoSense中，獲得了Synechochoccus sp（藍(lán)藻）、微微真核生物（1-3μm大小的混合種群）和納米真核生物的計(jì)數(shù)（2-10μm大?。?，同時(shí)onCyt提供非熒光，主要是異養(yǎng)細(xì)菌的濃度。盡管對(duì)于自養(yǎng)微微浮游生物（藍(lán)藻和微微真核生物），onCyt系統(tǒng)與傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的比較已有報(bào)道，而且對(duì)于異養(yǎng)微生物，onCyt系統(tǒng)已用于淡水系統(tǒng)，但其在海水中的應(yīng)用仍需測(cè)試。因此，我們調(diào)整了染色方案，以適應(yīng)onCyt在培養(yǎng)溫度和時(shí)間方面的需要。為了保證測(cè)量的準(zhǔn)確性，在含50 mM EDTA染色之前，樣品中加入多聚甲醛和戊二醛的混合物（1%和0.05%最終濃度）。使用CytSense和onCyt獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù)與通過(guò)常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)獲得的計(jì)數(shù)顯著正相關(guān)，如圖所示，對(duì)于細(xì)菌，計(jì)數(shù)和亞群（高核酸，HNA和低核酸，LNA，圖1c和d）都適用。
圖1 通過(guò)CytoSense、onCyt和常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)（Verse）獲得的數(shù)據(jù)驗(yàn)證。
a）CytoSenseVs Verse藍(lán)藻聚球藻計(jì)數(shù)的相關(guān)性b）onCyt Vs Verse總異養(yǎng)細(xì)菌計(jì)數(shù)的相關(guān)性c）通過(guò)onCyt獲得的異養(yǎng)細(xì)菌的流式圖d）通過(guò)Verse獲得的異養(yǎng)細(xì)菌生的流式圖
上船后，兩臺(tái)流式細(xì)胞儀在熱鹽分析儀之后連接到船上的采樣線上。然后海水被分成兩條線，一條通向CytSense，另一條通向onCyt。兩臺(tái)儀器同時(shí)采集了樣本。
圖2 顯示了船的軌跡以及巡航期間收集的溫度、鹽度和熒光值。
兩個(gè)低鹽度區(qū)域很明顯，一個(gè)靠近港口（Torre Annunziata），另一個(gè)位于受薩諾河（Sarno）影響的區(qū)域。第一個(gè)位于離海岸一英里的城市垃圾收集站附近。第二條河流與薩諾河相對(duì)應(yīng)，薩諾河流經(jīng)幾個(gè)農(nóng)村和城市地區(qū)，然后排入那不勒斯灣。a）溫度，b）葉綠素?zé)晒猓琧）航跡，d）鹽度。箭頭表示鹽度較低的地點(diǎn)，Torre Annunziata（上圖）和Sarno（下圖）
細(xì)菌總濃度顯示出這兩個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)的峰值，第一個(gè)區(qū)域（Torre Annunciata）的最高濃度為1.5 x 106cell/ml，第二個(gè)區(qū)域（Sarno）的濃度為1.4 x 106cell/ml（圖3）。盡管HNA在Torre Annunziata占主導(dǎo)地位，但HNA和LNA均存在于Sarno現(xiàn)場(chǎng)（未顯示），表明采樣軌跡沿線的群落組成發(fā)生了變化。事實(shí)上，HNA和LNA現(xiàn)在被識(shí)別為不同的細(xì)菌集群，最終代表了相同的較大分支，但屬于不同的分類單元，而不像以前認(rèn)為的那樣，是更多（HNA）或更少（LNA）活性細(xì)菌。
圖3 樣本軌跡（左側(cè)）和中異養(yǎng)細(xì)菌總濃度（右側(cè)）cell/ ml
在Sarno現(xiàn)場(chǎng)采集的樣本顯示存在大腸桿菌，這是近期糞便污染的指標(biāo)，但在Torre Annunziata現(xiàn)場(chǎng)（Milva Pepi，pers.Comm.）沒(méi)有，這表明在僅根據(jù)細(xì)菌總濃度正確評(píng)估人類健康風(fēng)險(xiǎn)之前，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌分析的重要性。有毒藻類也是如此，其中單獨(dú)的分類鑒定并不總是與必須使用其他適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法證明的毒素的存在相對(duì)應(yīng)。
自養(yǎng)微生物組分也顯示出兩個(gè)區(qū)域之間的明顯分離，藍(lán)細(xì)菌聚球藻（Synechococcus）在南部地區(qū)占優(yōu)勢(shì)，而微微真核生物和隱藻在北部地區(qū)占優(yōu)勢(shì)（圖4）。這也證實(shí)了先前的觀察結(jié)果，表明原核生物（藍(lán)藻）與大型真核生物（微微真核生物和隱藻）對(duì)不同的環(huán)境線索做出反應(yīng)，后者通常負(fù)責(zé)總?cè)~綠素的峰值（如熒光模式所示，圖1b）。
圖4 樣本軌跡（左側(cè)）和a）聚球藻b）微微真核生物c）隱藻濃度cell/ml自動(dòng)高頻流式細(xì)胞儀被證明是一種檢測(cè)海洋微生物的成本效益高、速度快的方法，允許實(shí)時(shí)測(cè)量細(xì)胞濃度與環(huán)境因素相關(guān)性，以便解釋和潛在地用作水質(zhì)標(biāo)志，并為進(jìn)一步干預(yù)鋪平道路。反過(guò)來(lái)，微生物群落，特別是異養(yǎng)細(xì)菌，似乎是環(huán)境條件變化的有用標(biāo)志，需要考慮并納入水質(zhì)評(píng)估，如歐洲指令2008/56/EC所要求的，其目標(biāo)是在2020年內(nèi)達(dá)到所有歐洲水域的良好環(huán)境狀態(tài)（GES）。
由于細(xì)菌細(xì)胞總數(shù)可能不會(huì)進(jìn)一步反映致病性或毒性對(duì)人類健康的風(fēng)險(xiǎn)，因此必須謹(jǐn)慎行事。然而，流式細(xì)胞術(shù)可能是首次篩選的一種有價(jià)值的方法，實(shí)時(shí)預(yù)警潛在的關(guān)鍵位點(diǎn)，以便通過(guò)其他方法進(jìn)一步監(jiān)測(cè)和控制。
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