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如何選擇葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng),看這篇文章就夠了~
日期:2023-08-16 19:01:21

如今市面上有很多被稱為葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)的設(shè)備。單就設(shè)備的型號(hào)來講,已經(jīng)不下十幾種,如,***PAM,***CAM,***Explorer,***View等等,進(jìn)口的,國產(chǎn)的,封閉式的,開放式的,多功能的,多光譜的,高通量的,那叫一個(gè)眼花繚亂。如果這個(gè)時(shí)候廠家再給你一堆花花綠綠的圖片在您眼前不斷的閃現(xiàn),請(qǐng)問您該如何和判斷這是什么?我要的是什么?好難!


葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)是測(cè)量光合作用光反應(yīng)能量轉(zhuǎn)換過程釋放的葉綠素?zé)晒獾某上窆ぞ摺?strong style=";padding: 0px;max-width: 100%;box-sizing: border-box !important;overflow-wrap: break-word !important">首先它是測(cè)量葉綠素?zé)晒獾?,其次它可以成像?/strong>這下反而簡單了。


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測(cè)量葉綠素?zé)晒獾姆椒ㄓ泻芏喾N,目前受歡迎和應(yīng)用廣泛的是脈沖振幅調(diào)制(PAM)方法。下面的測(cè)量流程以脈沖振幅調(diào)制方法展開:在開始測(cè)量之前,葉片必須經(jīng)過幾分鐘或者幾十分鐘的暗適應(yīng),這取決于測(cè)量前葉子所處光環(huán)境的光強(qiáng)度和植物物種。黑暗中葉綠素a熒光的最小水平Fo通過低強(qiáng)度測(cè)量光(Measure Light, ML)獲得,而暗適應(yīng)葉片的最大熒光產(chǎn)量Fm則用飽和光脈沖(Saturation Pulse, SP)進(jìn)行評(píng)估。在光化光照明(Actinic Light, AL, 即施加的光強(qiáng)度)下,可以使用另一個(gè)飽和脈沖估計(jì)光適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光Fm′。在施加的光化光AL關(guān)閉之前測(cè)量熒光的穩(wěn)態(tài)水平Fs。除此之外,在關(guān)閉AL后(有時(shí)需要開遠(yuǎn)紅光Far Red Light, FR),可以測(cè)到另一個(gè)葉綠素?zé)晒獾淖畹退紽o′。Fm′和Fo′之間的差異是光下的最大可變熒光Fv′。根據(jù)這些測(cè)量的基本葉綠素?zé)晒鈪?shù),可以計(jì)算出其他一些更常用于葉綠素?zé)晒夥治龅膮?shù)。


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常見的葉綠素?zé)晒鈪?shù)


葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量解決了,下面該討論成像了。葉綠素?zé)晒獬上窨蓻]那么簡單,因?yàn)樗粏螁问桥恼?。拍照是一門光學(xué)藝術(shù),風(fēng)景,人物拍照講究個(gè)構(gòu)圖得當(dāng),光線協(xié)調(diào),亮暗對(duì)比,但是這些都不適用于葉綠素?zé)晒獬上?。葉綠素?zé)晒獬上裨摽紤]哪些因素呢?


首先要考慮的是測(cè)量區(qū)域光場的均勻性。所謂的測(cè)量區(qū)域光場的均勻性是指在成像區(qū)域內(nèi),各個(gè)不同位點(diǎn)的光強(qiáng)差異,差異越小,光場越均勻。光場內(nèi)的光強(qiáng)包括測(cè)量光,光化光,飽和脈沖光,遠(yuǎn)紅光。是否均勻是衡量葉綠素?zé)晒獬上駭?shù)據(jù)是否有效的基本原則。因?yàn)橹挥性诠鈭鼍鶆虻那闆r下,才可以保證成像區(qū)域內(nèi)樣品上的每一點(diǎn)接受到的光強(qiáng)是一致的,才可以進(jìn)行多葉片同時(shí)測(cè)量,才可以進(jìn)行橫向異質(zhì)性分析。否則,數(shù)據(jù)的有效性無從談起。實(shí)踐證明,熒光成像系統(tǒng)并不是成像面積越大越好,首先要考慮的是成像均勻。如果光場不均勻,再大的成像面積也是無效面積,外圍和中心的測(cè)量結(jié)果也不具備可比性。


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成像區(qū)域108個(gè)點(diǎn)的光強(qiáng)數(shù)據(jù)


其次要考慮的是工作距離。所謂的工作距離是指樣品和測(cè)量系統(tǒng)的光源以及成像的鏡頭的空間距離。工作距離和光場的均勻性是密切相關(guān)的,換句話說,光場在一個(gè)工作距離下是均勻的,換一個(gè)工作距離就不一定了。其次工作距離還影響樣品表面接收到的光強(qiáng),距離越遠(yuǎn)接收到的光強(qiáng)越弱。實(shí)際應(yīng)用中,如果工作距離發(fā)生變化,請(qǐng)務(wù)必重新做光強(qiáng)校準(zhǔn)。否則樣品實(shí)際接收的光強(qiáng)可能會(huì)與軟件顯示的光強(qiáng)不一致,不能正確反應(yīng)樣品的實(shí)際生理狀態(tài)。


第三要考慮的是成像面積。所謂的成像面積是在設(shè)定的工作距離下測(cè)量區(qū)域光場均勻的有效面積。由此可見,成像面積和工作距離是密切相關(guān)的,光場均勻的區(qū)域才算有效面積,有效面積內(nèi)的所有位置被無差別測(cè)量,圖像內(nèi)的所有信息才有可比性。


第四個(gè)要考慮的是光源光強(qiáng)。光強(qiáng)包括測(cè)量光,光化光,飽和脈沖光的光強(qiáng)。1.測(cè)量光,它既不能太強(qiáng),也不能太弱。測(cè)量光太弱,無法將本底熒光全部激發(fā)出來,導(dǎo)致飽和脈沖測(cè)量的可變熒光Fv包含部分Fo,F(xiàn)v被高估。測(cè)量光太強(qiáng),會(huì)破壞暗適應(yīng)的狀態(tài),導(dǎo)致測(cè)量的Fv被低估。2.光化光,它是在葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量過程中誘導(dǎo)植物發(fā)生光合作用的光,通常強(qiáng)度是可調(diào)的。如果使用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)測(cè)量光響應(yīng)曲線的話,光化光的強(qiáng)度通常需要達(dá)到1500-2000 μmol m-2 s-1。3.飽和脈沖光,它是用來測(cè)量和計(jì)算數(shù)據(jù)的光,在飽和脈沖期間,光系統(tǒng)被全部關(guān)閉,此時(shí)可以根據(jù)熒光發(fā)射的多少計(jì)算光化學(xué)淬滅和非光化學(xué)淬滅以及電子傳遞。飽和脈沖光的強(qiáng)度通常需要在3000-5000 μmol m-2 s-1以上。


總結(jié)一下,目前的葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)還是一個(gè)平面2D應(yīng)用的測(cè)量系統(tǒng)。您也許會(huì)說,植物是立體的呀!是的,植物沒有錯(cuò),但是考慮到光源,成像鏡頭和樣品的空間距離是線性的。所以葉綠素?zé)晒獬上褚彩瞧矫?D的,既然是平面測(cè)量系統(tǒng),那么就要考慮成像區(qū)域的光場均勻性,就要時(shí)刻注意光源和鏡頭與葉片之間的距離,一個(gè)實(shí)驗(yàn)中的所有樣品要以相同的距離進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量前準(zhǔn)備階段的光強(qiáng)校準(zhǔn)也要在這個(gè)距離下進(jìn)行。最后,葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)的光源配置要滿足葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量的基本要求。


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所以,我們想從專業(yè)服務(wù)的角度給各位老師和同學(xué)提兩點(diǎn)建議。1.如果您正在使用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng),請(qǐng)認(rèn)真思考上面提到的四點(diǎn),非常重要。2.如果您計(jì)劃采購葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng),同樣需要關(guān)注上面提到的四點(diǎn),非常重要!


除了上面提到的四點(diǎn)以外,葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)還有一些其他的技術(shù)參數(shù)需要注意,比如CCD的幀率,鏡頭的焦距,對(duì)焦,光圈等,這些參數(shù)也會(huì)影響成像結(jié)果,您把它比作一臺(tái)數(shù)碼相機(jī)就很好理解了。下面我們分別了解一下這幾個(gè)參數(shù)。


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1.CCD的幀率:理論上幀率越高,畫面越流暢,但也不是幀率越高越好,它還取決于顯示終端的顯卡配置,被測(cè)光源類型。百度百科搜索“幀率”您會(huì)看到以下內(nèi)容“大多數(shù)研究參與者認(rèn)為調(diào)制光穩(wěn)定。這種調(diào)制光的穩(wěn)定感被稱為閃爍融合閾值。然而,當(dāng)調(diào)制光是不均勻的并且包含圖像時(shí),閃爍融合閾值可以高得多,數(shù)百赫茲”。如果我沒理解錯(cuò)的話,調(diào)制光如果不均勻的話,閃爍融合閾值越高,圖像穩(wěn)定感越差。目前大多數(shù)葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)的幀率為每秒30幀,屬于正常水平,也相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定可靠。另外一點(diǎn),葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)是一個(gè)”拍照“設(shè)備,不是一個(gè)“錄像”設(shè)備。無論您使用的是脈沖式還是調(diào)制式,我們都需要用到飽和閃光測(cè)量葉片的“瞬時(shí)”狀態(tài)并成像,輸出的也都是2D圖像,所以無需過分糾結(jié)幀率。


2.鏡頭焦距,對(duì)焦,光圈:這三個(gè)屬于鏡頭的常規(guī)參數(shù),其實(shí)沒什么好說的,但是如果不注意的話還是會(huì)影響測(cè)量結(jié)果。A,焦距可以放大(拉近)/縮?。ǚ胚h(yuǎn))圖像,調(diào)整焦距并不會(huì)改變?nèi)~片與鏡頭和光源的距離。對(duì)測(cè)量不會(huì)產(chǎn)生本質(zhì)性的影響。B,對(duì)焦可以使圖像邊緣更加清晰,通常調(diào)整焦距后都需要重新對(duì)焦,否則圖像中的葉片邊緣可能是模糊的,輸出的熒光參數(shù)圖像里的葉片邊緣也是模糊的。C,光圈由通光孔葉片組控制的位于鏡頭中央的圓孔,光圈的大小決定了通過鏡頭到達(dá)檢測(cè)器的光線多少。這里值得一提的是光圈F/值越小,光圈孔徑越大,進(jìn)入的光線越多,圖像越明亮。所以在測(cè)量過程中最好不要隨意更改光圈大小,特別是在用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)測(cè)量吸光度Absorptivity(Abs.)的時(shí)候,更是嚴(yán)禁調(diào)整光圈大小,如果不小心調(diào)了,需要重新調(diào)整Abs.測(cè)量所用光源的參數(shù)。如果之前沒在意光圈大小,做預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)測(cè)量光調(diào)到最低(Meas light Int.=1,Gain=1)AOI的Ft仍大于測(cè)量要求的上限值,此時(shí)需要先調(diào)整光圈,然后再到Settings設(shè)置測(cè)量參數(shù)。相反,如果測(cè)量光已經(jīng)調(diào)到很大,AOI的Ft仍不到測(cè)量要求的下限值,也需要先調(diào)整光圈,然后再到Settings設(shè)置測(cè)量參數(shù)。


綜上所述,IMAGING-PAM不僅僅是數(shù)據(jù)圖像化那么簡單。它可以成像,但又不僅僅是成像,所以不能像數(shù)碼相機(jī)那樣隨意構(gòu)圖,也不能產(chǎn)出光影效果俱佳的大片。它可以成像,但又不僅限于成像,它可以分辨葉片上肉眼不可見的差異,是測(cè)量植物光合生理的精密的科研工具,需要嚴(yán)謹(jǐn)對(duì)待。
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截至目前,德國WALZ公司共推出了5個(gè)版本的葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng),分別是HEXAGON-IMAGING-PAM, 3D-IMAGING-PAM, MAXI-IMAGING-PAM, MINI-IMAGING-PAM, MICROSCOPY-IMAGING-PAM, Mobile-IMAGING-PAM。

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HEXAGON版本的IMAGING-PAM是為更大測(cè)量面積需求而生的新版葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)。可以對(duì)480 cm2的區(qū)域進(jìn)行均勻成像。可以實(shí)現(xiàn)更多樣平的同時(shí)測(cè)量。

M系列MAXI版本是目前應(yīng)用最廣泛的一個(gè)版本。首先,它在測(cè)量面積上實(shí)現(xiàn)了11×15cm的大面積成像。其次MAXI-IMAGING-PAM的硬件組裝方式可以非常靈活,經(jīng)簡單的調(diào)整好即可適應(yīng)一些復(fù)雜的工作狀況。


M系列的MINI版的探頭是葉夾式的,可以直接夾住葉片測(cè)量即可,可以攜帶至野外使用。


M系列MICROSCOPY版是用于微藻或葉片顯微結(jié)構(gòu)組織水平測(cè)量的系統(tǒng)。


3D版是套機(jī),光源和鏡頭都固定在框架上,不可拆卸,3D版除了葉綠素?zé)晒獬上褚酝饪梢杂糜谛⌒椭仓辏〝M南芥)3D成像,分析植株的表型,如葉片數(shù)量,葉面積等。


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Mobile版是MINI版的變形,是專為雜草或貼地植物設(shè)計(jì)的版本,符合人體工學(xué)的背帶,延長的手柄大大提高了野外測(cè)量的便攜性,非常適合研究除草劑對(duì)雜草作用效果,在除草劑的研發(fā)和雜草管理上積累了大量的應(yīng)用。


IMAGING-PAM不僅僅是數(shù)據(jù)圖像化那么簡單。


IMAGING-PAM葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)發(fā)表的文章非常多,涉及的樣品類型五花八門,最常見的有擬南芥植株,單個(gè)葉片,藻液,藻斑,苔蘚,珊瑚,甚至還有愈傷組織。針對(duì)不同的樣品類型,測(cè)量時(shí)面臨的實(shí)際問題也千差萬別。比如,我們要求原位活體測(cè)量,盡量不要離體,但是有些植株體量比較大,無法整個(gè)放到成像區(qū)域,再比如有些樣品葉柄比較短,也同樣面臨類似的問題,還有測(cè)量藻液,如何才能避免液面的反光等等。當(dāng)我們遇到上面這些問題時(shí)該如何解決,怎么樣才能保證測(cè)量是準(zhǔn)確的?


具體情況需要具體分析,如果要展開講,一篇文章也不一定能講清楚,但我們還是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)還是總結(jié)了一些比較重要的注意事項(xiàng),通過這篇文章分享給大家。澤泉科技作為WALZ的技術(shù)服務(wù)中心,對(duì)IMAGING-PAM特別熟悉,所以以它為例來講,如果您用的是其它品牌或型號(hào)的葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng),也可以參考,畢竟原理是相通的。倘若下文內(nèi)容與您接受設(shè)備培訓(xùn)聽到的測(cè)量理論有差別,歡迎各位讀者朋友留言咨詢,我們可以詳細(xì)交流,共同學(xué)習(xí)。


首先,我們可以看看IMAGING-PAM成像的圖片在文獻(xiàn)中是什么樣子的。然后再了解實(shí)際應(yīng)用中有哪些使用要求,變形方式。下面的圖片展示了IMAGING-PAM測(cè)量擬南芥植株,擬南芥平板,大型植株,盛放藻類懸浮液的多孔板,巖石附著藻,苔蘚等出現(xiàn)在發(fā)表文章中的圖片。不難看出,IMAGING-PAM在不同類型的樣品中積累了大量的應(yīng)用。


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下面,我們以經(jīng)典的MAXI-IMAGING-PAM來看看在實(shí)際應(yīng)用中根據(jù)不同樣品類型它有哪些變形方式。從下圖中不難看出,只需要簡單的更改組裝方式,即可實(shí)現(xiàn)封閉,半開放,開放式測(cè)量。離體葉片,盆栽,大型植株,盛放藻類的96孔板均可輕松搞定。


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不同組裝方式可以讓系統(tǒng)變得靈活,適用多變的實(shí)驗(yàn)需求,但是測(cè)量的本質(zhì)沒有變,還是葉綠素?zé)晒?。所以,一些測(cè)量的基本原則必須搞清楚,如工作距離,成像面積,測(cè)量區(qū)域光場的均勻性,光強(qiáng)(光化光+飽和脈沖)的強(qiáng)度等等,以上這些因素都會(huì)影響到您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。


1. 測(cè)量區(qū)域光場的均勻性:MAXI版的IMAGING-PAM光源陣列的LED排布是經(jīng)過精心設(shè)計(jì)的,目的就是為了保證測(cè)量區(qū)域光場均一。經(jīng)測(cè)算,MAXI 版IMAGING-PAM的光場均一性在標(biāo)準(zhǔn)工作距離18.5 cm時(shí)最優(yōu)可達(dá)2%。MINI版本的IMAGING-PAM光源為四角相對(duì)排布,外圍尺寸9.4×8.6 cm,但是為了保證成像區(qū)域光場均勻,實(shí)際的成像面積則僅保留了2.4×3.2 cm的有效區(qū)域。測(cè)量區(qū)域光場的均勻性同樣是HEXAGON版本的旗艦參數(shù)。無論是MAXI版還是MINI版,再到現(xiàn)在最新的HEXAGON,德國WALZ始終堅(jiān)守著該項(xiàng)技術(shù)的嚴(yán)謹(jǐn)性。


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2.工作距離:為以MAXI版為例,工作距離根據(jù)組裝方式的不同可以實(shí)現(xiàn)14.5-22.5 cm可調(diào)。標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置下,打開成像單元紅色的護(hù)眼罩,放入樣品架,然后在樣品架上放置葉片,葉片平展,此時(shí)葉片表面距離光源和鏡頭的距離即為標(biāo)準(zhǔn)工作距離18.5 cm。如果LED陣列和鏡頭脫離護(hù)眼罩,則可以很方便的調(diào)整工作距離。MINI版本的工作距離通常為固定的7 cm。HEXAGON版本的標(biāo)準(zhǔn)工作距離為20 cm。


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3.成像面積:MAXI版工作距離為14.5 cm的時(shí)候,成像面積為7.5×10 cm;工作距離為22.5 cm的時(shí)候,成像面積是11×15 cm。MINI版工作距離為固定的7 cm,成像面積為2.4×3.2 cm。HEXAGON在標(biāo)準(zhǔn)工作距離下成像面積為20×24 cm。IMAGING-PAM的成像面積即為有效面積,有效面積內(nèi)的所有位置被無差別測(cè)量。


4. 光源光強(qiáng),以MAXI版IMAGING-PAM目前搭載的LED光源陣列為例,需要300 W的額外供電。標(biāo)準(zhǔn)工作距離18.5 cm,光化光最大可達(dá)1900 μmol m-2 s-1PAR,大大超過所有植物的光飽和點(diǎn)。飽和脈沖最高可達(dá)4000 μmol m-2 s-1PAR,足夠關(guān)閉所有光系統(tǒng)的反應(yīng)中心。HEXAGON-IMAGING-PAM的光源性能有了大幅的提升,標(biāo)準(zhǔn)工作距離20 cm,光化光最大可達(dá)3000 μmol m-2 s-1PAR,飽和脈沖最高可達(dá)5000 μmol m-2 s-1PAR,因此HEXAGON-IMAGING-PAM在工作距離上還有一定的調(diào)整空間。


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IMAGING-PAM有非常多的應(yīng)用,在我們整理的光合作用文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫中,是發(fā)表文章較多的型號(hào),單個(gè)型號(hào)超過1800篇。2021年,IMAGING-PAM參與發(fā)表的相關(guān)論文曾兩次登上專業(yè)期刊的封面。德國WALZ掌握葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)的核心技術(shù)。IMAGING-PAM,值得您的信任~


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