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aBIOTECH:用于水稻核心啟動子編輯的CRISPR/FrCas9系統(tǒng)的開發(fā)
日期:2024-05-31 22:25:30

近年來,CRISPR/Cas9技術(shù)在作物研究中取得了重要進(jìn)展。然而,由于農(nóng)業(yè)重要性狀大多是定量性狀,因此編輯啟動子以調(diào)控基因表達(dá)強度變得十分重要。真核生物啟動子由核心啟動子區(qū)域和上游順式調(diào)控元件(CREs)組成。通過靶向多個CREs來實現(xiàn)基因表達(dá)的改變通常是耗時的。相反,核心啟動子區(qū)域中的突變卻可以引起下游基因轉(zhuǎn)錄本的豐度顯著變化。然而,但受限于序列特征,常用的CRISPR系統(tǒng)通常難以用于核心啟動子編輯。最近發(fā)現(xiàn)的FrCas9與TATA PAM兼容,特別是與核心啟動子TATA盒序列兼容。然而,F(xiàn)rCas9的活性及其在植物中的編輯模式尚未確定。

近期,安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所李娟與安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)魏鵬程團(tuán)隊在aBIOTECH發(fā)表了題為“Developing a CRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice”的研究論文。研究團(tuán)隊設(shè)計了一種獨特的FrCas9系統(tǒng),并利用該系統(tǒng)在水稻中進(jìn)行基因編輯,展示了其編輯植物核心啟動子區(qū)域的潛力。

圖024053105.jpg

為了驗證FrCas9系統(tǒng)的核心啟動子編輯能力,作者使用TATA盒序列作為PAM,在Nipp(Oryza sativa L.cv Nipponbare)對白葉枯病菌(Xoo)易感基因OsSWEET13的近端啟動子上設(shè)計sgRNA。此外,為了直接監(jiān)測編輯活性,設(shè)計了一個sgRNA以靶向水稻PDS基因。在48個PDS轉(zhuǎn)基因植株中,獲得了六個白化植株,表明FrCas9系統(tǒng)在水稻中具有活性。

為了評估FrCas9系統(tǒng)編輯TA豐富序列時的潛力以及在水稻中的編輯表現(xiàn),作者在水稻PDS基因位點上設(shè)計了16個包含所有可能的5'-NNTA-3' PAM的sgRNA,通過對穩(wěn)定轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的高通量測序表明,F(xiàn)rCas9系統(tǒng)編輯效率范圍從1.1%到35.3%,表明FrCas9的高PAM兼容性。FrCas9系統(tǒng)在TGTA、TATA和AGTA PAM位點編輯效率較高,分別達(dá)到35.3%、33.8%和32.1%,這與NNTA PAM的第二個核苷酸偏好為R(A/G)的假設(shè)一致。

為了進(jìn)一步測試FrCas9的核心啟動子編輯能力,作者設(shè)計了一個帶有TGTA PAM的sgRNA,靶向水稻WaxyWX)基因啟動子中非典型TATA(TACAAAT)序列。利用FrCas9編輯獲得了WXiA和WXiT純合編輯植株,純合/雙等位突變效率為50%。突變植株中WX表達(dá)量顯著下調(diào),導(dǎo)致了直鏈淀粉含量(AC)顯著下降。同時,作者使用TATA為PAM的兩個相向靶點,實現(xiàn)了FrCas9介導(dǎo)的雙向編輯,在核心啟動子區(qū)產(chǎn)生多重突變和小片段精確缺失。此外,構(gòu)建了源自FrCas9的堿基編輯器A3A-FrBE3和FrABE8e,并在T0轉(zhuǎn)基因植株中的評估其性能,結(jié)果顯示其具有較高編輯高精度。

圖124053105s.jpg

CRISPR/FrCas9系統(tǒng)介導(dǎo)水稻基因組編輯

該研究在植物中建立了FrCas9介導(dǎo)的基因敲除和堿基編輯系統(tǒng),并實現(xiàn)功能基因核心啟動子的高效編輯,為基因表達(dá)的微調(diào)和新種質(zhì)的創(chuàng)制提供了技術(shù)支撐。

—— 原文 ——

Wang H, Ding J, Zhu J, et al, et alDeveloping a CRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice[J]. aBIOTECH, 2024: 1-7. 

北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心是由北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司和上海澤泉科技股份有限公司共同建設(shè)的開放式高通量植物基因型-表型-育種服務(wù)平臺。中心建立了基因克隆和載體平臺、作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、基因型分析平臺、表型鑒定分析平臺、數(shù)據(jù)分析和利用平臺等現(xiàn)代化生物技術(shù)和信息支持平臺,是定位于為植物科研和作物育種提供植物基因型-表型-育種數(shù)據(jù)分析的科研服務(wù)平臺。

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