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Ampha Z32阻抗流式細胞儀(IFC)在真核細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用
日期:2021-09-14 17:40:04
細胞活力的測定在生命科學(xué)和生物技術(shù)的許多領(lǐng)域都是必不可少的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)上,細胞活力通常通過寬視野光學(xué)顯微照片中染色細胞的半自動或自動計數(shù)來確定,通常這種檢測方法需要額外的染色標記過程,故很難作為在線或原位快速檢測的手段。Ampha Z32微流控阻抗流式細胞儀(IFC)是一種基于Coulter原理的無需標記的單細胞檢測技術(shù),可在線快速、準確測定懸浮液中單細胞的活性狀態(tài)。Ampha Z32不含光學(xué)元件,無需調(diào)整和校準,便于攜帶,不僅可在實驗室使用,還同樣適用于實驗室外的檢測。此前,Ampha Z32多用于花粉質(zhì)量分析,但目前其也逐步應(yīng)用到細胞生物學(xué)的許多領(lǐng)域,如檢測癌細胞的活力、分化和凋亡(Ampha Z32阻抗流式細胞儀在癌細胞狀態(tài)鑒定中的應(yīng)用);監(jiān)測牛紅細胞寄生蟲感染過程;成纖維細胞分化為脂肪細胞的研究;甚至是納米材料毒性評估(Ampha Z32阻抗流式細胞儀在納米材料毒性篩選中的應(yīng)用)等方面。本文利用Ampha Z32精確并快速的評估了正常和熱滅活、發(fā)酵過程中以及長期好氧間歇培養(yǎng)過程中酵母細胞的細胞活力和細胞狀態(tài),并與常規(guī)染色方法進行了比較。此外,還監(jiān)測了感染桿狀病毒后昆蟲細胞活性的變化并預(yù)測了胞內(nèi)蛋白的理想收獲時間。

 
釀酒酵母細胞的活性檢測

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圖1 IFC法與PI熒光染色法測定的酵母活性的相關(guān)性
A)10MHz頻率下釀酒酵母(Scc ATCC 9080)活細胞(未處理;綠點)和死細胞(熱處理;紅點)的IFC相位角(x軸)-振幅(y軸)疊加散點圖;B)IFC法(n=3,std=0.15%)和染色法(n=3,std=4.4%)的相關(guān)性分析(R2=0.996)

IFC法:本實驗中未經(jīng)處理和熱處理的酵母死細胞樣品按預(yù)定比例(1:0、3:1、1:1、1:3、0:1)混合至100μl,之后用AF6緩沖液進一步稀釋至2ml,經(jīng)20μm過濾器過濾后上機測試,三次重復(fù),細胞采集數(shù)目設(shè)定為20000。

PI法:200μl AF6和100μl 3.0μg/ml碘化丙啶(PI)稀釋100μl上述未經(jīng)處理/熱處理的細胞混合物,并使用熒光顯微鏡(Leica)計數(shù)PI染色(死亡)和未染色(存活)細胞。

實驗結(jié)果表明,相較于傳統(tǒng)染色鏡檢法,Ampha Z32阻抗流式細胞儀(IFC)操作簡單、測量快速,是一種統(tǒng)計性、重復(fù)性、測量精度以及標準化程度都更高的檢測方法。

常規(guī)培養(yǎng)下和兩性霉素B(Sigma)處理后釀酒酵母活性的變化

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圖2 常規(guī)培養(yǎng)下釀酒酵母(Scc ATCC9080)活性的變化(IFC法)

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圖3. 常規(guī)培養(yǎng)下和兩性霉素B(Sigma)處理后釀酒酵母活性的變化
A)常規(guī)培養(yǎng)下,釀酒酵母(Scc ATCC 9080)活性相位直方圖隨時間的變化(10 MHz)。
B)酵母活性隨培養(yǎng)時間的變化曲線。
C)在添加1μg/ml的兩性霉素B后的0-5h內(nèi),釀酒酵母(Scc ATCC 9080)活性相位直方圖的變化

釀酒酵母(Scc ATCC 9080)常規(guī)培養(yǎng),即250 ml錐形瓶中在28°C的搖動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天,培養(yǎng)基為100 ml YPD。兩性霉素B(Sigma)處理,即將常規(guī)培養(yǎng)中處于指數(shù)生長時期的釀酒酵母細胞暴露于1μg/ml的兩性霉素B中。圖2為接種培養(yǎng)后的第1、7和14天,釀酒酵母的相位-振幅散點圖的變化,從圖中可以看出,在接種培養(yǎng)的第7天出現(xiàn)兩個明顯可區(qū)分的類群。在培養(yǎng)的18天中,可以清晰看到活性酵母類群的逐漸向低相位和較小振幅移動(圖3A),也就是說,隨著培養(yǎng)時間的延長,酵母細胞活性逐漸下降(圖3B)。此過程反映了在長期好氧間歇培養(yǎng)中,因營養(yǎng)限制而導(dǎo)致的酵母細胞的死亡過程。圖3C同樣觀察到經(jīng)兩性霉素B(Sigma)處理后,釀酒酵母細胞的活性逐漸降低,但這一過程反映的是毒性化合物誘導(dǎo)下酵母細胞的死亡過程。這表明IFC還可應(yīng)用于懸浮細胞的無標記毒理學(xué)研究,例如用于IC50值的測定。
 
釀啤酒造過程中釀酒酵母活性的變化

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圖4. 釀啤酒造過程中釀酒酵母活性的變化
A) 開始發(fā)酵后的前3天,酵母細胞的相位-振幅散點圖變化。
B)  發(fā)酵過程中的酵母細胞的密度(黑色)、活力(橙色)和乙醇濃度(藍色)隨時間的變化。

啤酒釀造發(fā)酵罐中的生長條件與前面討論的情況不同,圖4記錄了酵母的發(fā)酵過程,開始的第1天(紅色)到第2天(綠色),酵母細胞呈指數(shù)增殖,細胞濃度從5.4增加到25.3 x 106細胞/ml,細胞活力從57.1增加到83.9%(圖4B)。第3天結(jié)束時,酵母細胞(藍色)移向較低的相角,這意味著細胞濃度的增長減慢,細胞活力下降。而發(fā)酵罐中乙醇濃度從第一天的0.1%迅速增加到第三天的3.1%(圖4B)。這是由于培養(yǎng)第一天細胞濃度低、活力低且發(fā)酵罐中仍存在大量氧氣,當發(fā)酵罐中的氧氣全部消耗完后,酵母轉(zhuǎn)入?yún)捬跻掖及l(fā)酵,乙醇濃度迅速增加,而乙醇濃度增加又會對酵母細胞產(chǎn)生毒性,故酵母細胞活性降低。IFC的檢測到的活性相位變化與以上響應(yīng)過程高度一致。

Sf9昆蟲細胞活性檢測

本文利用Ampha Z32(IFC)分別跟蹤了感染和未感染染桿狀病毒(BV)的Sf9昆蟲細胞培養(yǎng)物在首次傳代后的99h內(nèi)的活力變化。

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圖5 感染桿狀病毒(BV)后的Sf9昆蟲細胞活性的變化

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圖S4 感染桿狀病毒(BV)后的Sf9昆蟲細胞活性相位疊加圖

上圖為Sf9昆蟲細胞在感染桿狀病毒后的數(shù)小時(hpi)內(nèi),相位-振幅散點圖的變化(0hpi為感染前的參考培養(yǎng)物)。在BV感染從0到99 hpi的整個過程中,相位-振幅散點圖的可明顯分離出三個細胞類群,分為是活細胞(viable)、感染晚期(LPI)和死細胞(dead)類群(圖5)。類似于酵母(圖1),在較高的相位值(150?到220?)下分離出“活”細胞類群。這部分活細胞在感染后的0-48hpi,阻抗振幅增加了約60%,這與感染后細胞的“膨脹”狀態(tài)相一致。阻抗振幅的變化提供了感染水平的定量讀數(shù),可用于從病毒滴定分析中確定病毒與細胞比率(感染多重性,MOI)。48hpi后,活細胞的阻抗振幅降低(細胞萎縮)且數(shù)量逐漸減少,直至99hpi細胞全部死亡(見圖6)。感染晚期(LPI)細胞類群出現(xiàn)在較低相位,這部分細胞在0-60hpi逐漸增加隨后減少直至消失,這是由于感染后期的細胞裂解所致。

圖72109141.jpg

圖S3 未感染桿狀病毒(BV)的Sf9昆蟲細胞活性的變化

上圖為未感染桿狀病毒(BV)的Sf9昆蟲細胞活性的變化,同感染細胞一致,相位-振幅散點圖也可分離出活細胞(viable)、感染晚期(LPI)和死細胞(dead)類群。如圖所示,細胞活力(97.9 %±0.7 %)在79 hpi的連續(xù)生長過程中始終保持不變。僅當在99 hpi超過典型的繼代間隔時間時,細胞活力下降至約93.1%,這可能是由于營養(yǎng)限制或細胞密度過高所致。與感染的Sf9昆蟲細胞的相位-振幅散點圖(圖5)相比,未感染細胞的振幅分布(與細胞大小相關(guān))在0-60h內(nèi)略有變窄,而直到60h才明顯檢測到LPI(感染晚期)細胞類群,到99h時該類群略有增加。

感染桿狀病毒(BV)后的Sf9昆蟲細胞活力和重組蛋白表達的時間動力學(xué)變化

本文除利用IFC法、臺盼藍染色鏡檢法追蹤了感染桿狀病毒(BV)后的Sf9昆蟲細胞活性的動力學(xué)變化,還同時利用綠色熒光蛋轉(zhuǎn)染Sf9細胞以量化重組蛋白的產(chǎn)量,下圖為感染桿狀病毒(BV)后的Sf9昆蟲細胞活力和重組蛋白表達的時間動力學(xué)變化。

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圖6 感染桿狀病毒(BV)后的Sf9昆蟲細胞活力和重組蛋白表達的時間動力學(xué)變化

結(jié)果表明,在感染BV后的24hpi內(nèi),IFC法與臺盼藍成像細胞計數(shù)器的檢測結(jié)果高度一致;24-60hpi內(nèi),IFC法檢測到的活性快速下降到50%(紅實線),而臺盼藍成像細胞計數(shù)器檢測到的細胞活性下降緩慢,僅從100%下降到80%(藍實線);從60hpi后,細胞活性均快速下降,但到99hpi時,IFC法的檢測結(jié)果僅為5%,而臺盼藍成像細胞計數(shù)器的檢測結(jié)果為42%;整個測試過程中,兩者差異在79hpi時達到最大,分別為11%和78%。79hpi的相位-振幅散點圖(圖5)表明此時IFC法可以準確捕捉到細胞阻抗信號發(fā)生了巨大變化(細胞的大規(guī)模重組),而臺盼藍成像細胞計數(shù)器卻不能及時檢測到這一變化。
 
感染桿狀病毒(BV)后的Sf9昆蟲細胞大小的變化

在BV感染的不同階段,細胞大小有顯著差異。因此,臺盼藍成像細胞計數(shù)法通常用細胞大小表征BV感染的狀態(tài)和重組蛋白的產(chǎn)量質(zhì)量。如圖7所示,在23-60 hpi之間,感染細胞從最初的12.8μm膨脹到約16μm,然后在99 hpi時最終縮減到8.5μm(圖7A,紅色虛線)。這與IFC法獲得的平均振幅(圖7A,黑色虛線)的變化趨勢非常相似,分析表明,振幅數(shù)據(jù)與平均細胞大小有很好的相關(guān)性(R2=0.901)(圖7B)。也就是說IFC法不僅可以評估細胞的活力,還可以評估細胞的大小。

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圖7 感染桿狀病毒(BV)后的Sf9昆蟲細胞大小的變化
 
LPI(感染晚期)類群大小與重組蛋白產(chǎn)量的關(guān)系

相較于臺盼藍成像細胞計數(shù)法,IFC法可進一步將失活細胞區(qū)分為感染晚期(LPI)和死細胞(dead)兩個類群(圖5)。隨感染時間的延長,LPI類群的細胞在48-60 hpi內(nèi)逐漸增多,到72 hpi幾乎全部消失。這一類群的大小與裂解細胞中檢測到的表達trGFPuv的濃度相關(guān)(圖6,紅色虛線和黑色實線)。隨著BV感染的進一步發(fā)展,表達的trGFPuv隨細胞裂解釋放到培養(yǎng)基中(圖6,黑色虛線),其濃度的變化與IFC確定的死亡細胞總數(shù)的比例完全一致(圖6,紅色虛線)。盡管細胞外表達的trGFPuv的數(shù)量最終會超過細胞內(nèi)的trGFPuv,但培養(yǎng)基中的不必要反應(yīng)和裂解細胞釋放的蛋白酶可能會降低表達蛋白的質(zhì)量,因此研究者并不希望將這部分釋放的蛋白質(zhì)用于后續(xù)應(yīng)用。由于IFC法檢測到的LPI群體與表達的胞內(nèi)蛋白密切相關(guān),因此利用Ampha Z32(IFC)可以很好地預(yù)測胞內(nèi)蛋白的理想收獲時間。
 
以上研究表明,Ampha Z32(IFC)微流控阻抗流式細胞儀是一種快速、可靠、無標記的細胞活力檢測技術(shù)。不僅可以在發(fā)酵過程中可靠測定細胞活力,細胞大小的變化,評估培養(yǎng)條件;還可以在昆蟲細胞bv感染過程中篩選理想的表達條件、病毒滴度,預(yù)測BV昆蟲細胞系統(tǒng)中獲得胞內(nèi)蛋白的理想時間,可廣泛應(yīng)用于微生物和動物單細胞的培養(yǎng)中。

—— 原文 ——
Opitz C , Schade G , Kaufmann S , et al. Rapid determination of general cell status, cell viability, and optimal harvest time in eukaryotic cell cultures by impedance flow cytometry[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103(20).

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