欧美精品亚洲精品日韩专区va,亚洲欧美偷国产日韩18p,欧美日韩精品视频欧美一区,91精品伊人久久久大香线蕉91,亚洲国产精品综合久久久网络
Ampha Z32的應(yīng)用:定量細(xì)菌孢子萌發(fā)以評估宿主菌群對艱難梭菌感染的敏感性
日期:2022-02-28 16:44:17

孢子萌發(fā)對于細(xì)菌定殖是必要的第一步,孢子在結(jié)腸中的萌發(fā)速率依賴于宿主菌群的組成,宿主菌群可調(diào)控初級及次級膽鹽水平以控制艱難梭菌的孢子萌發(fā)。Biosensors and Bioelectronics上發(fā)表了一項最新研究,基于萌發(fā)的孢子有著更高的凈電導(dǎo)率這一特征,開發(fā)了一種基于阻抗檢測的高通量單細(xì)胞計數(shù)法(Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀,瑞士Amphasys),僅需4小時(傳統(tǒng)方法需24小時)即可評估艱難梭菌的孢子萌發(fā)情況,并可用于評估宿主菌群對艱難梭菌感染的易感性。

①   利用高通量單細(xì)胞阻抗計數(shù)法(>300 events/s)對活細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行定量;

②   相比于傳統(tǒng)的菌落分析方法(需24h),該方法僅需培養(yǎng)4h即可評估孢子萌發(fā)情況,檢測下限為每50μL樣本中約100個活細(xì)胞;

③   萌發(fā)的艱難梭菌孢子有更高的凈電導(dǎo)率,這在中等導(dǎo)電介質(zhì)(0.8S/m)內(nèi)造成了獨特的高頻(10 MHz)阻抗相分散(活細(xì)胞與失活細(xì)胞離散);

④   該方法可對比在不同的初級膽鹽水平下的艱難梭菌孢子萌發(fā)速率,并可用于評估宿主對艱難梭菌感染的易感性。

                           

圖122022802.jpg

圖1 實驗方案

圖1(a) 艱難梭菌孢子萌發(fā)到其營養(yǎng)體形式受到“正?!本褐泄采?xì)菌的抑制,該菌群分泌水解酶,能夠代謝初級膽鹽為次級膽鹽,而缺乏共生細(xì)菌的抗生素破壞菌群表現(xiàn)出較高的初級至次級膽鹽水平,導(dǎo)致孢子萌發(fā)增強;(b) 整體實驗時間表:包括孢子預(yù)處理、細(xì)菌生長、IFC(阻抗流式細(xì)胞儀)微流控表型分析和菌群驗證;(c)阻抗式細(xì)胞儀分析的具體樣品制備步驟;(d) 來自抗生素處理的小鼠模型的宿主菌群樣本的采集、制備和分析步驟。

圖222022802.jpg

圖2 艱難梭菌UK1孢子在不同水平?;悄懰猁}的標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的微生物學(xué)分析

圖2(a) 24小時內(nèi)的生長曲線顯示,隨著?;悄懰猁}水平的增加,孢子萌發(fā)率逐漸提高,由于營養(yǎng)性艱難梭菌的存在, 0.001% 、0.01%和 0.1%?;悄懰猁}水平下的吸光度分別在20h、18h、15h(用虛線標(biāo)記)與無?;悄懰猁}的對照組的吸光度相比,出現(xiàn)顯著差異(*p<0.05);(b) 24小時后的CFU分析結(jié)果顯示,含有0.1%?;悄懰猁}的生長培養(yǎng)基的孢子萌發(fā)顯著(****p<0.0001),而其他?;悄懰猁}水平下孢子萌發(fā)并不明顯;(c)培養(yǎng)4小時后的DEP歸一化光譜和頻譜結(jié)果顯示,含有0.1%?;悄懰猁}的DEP歸一化光譜與同質(zhì)營養(yǎng)體艱難梭菌勻質(zhì)樣品的DEP歸一化光譜(實線)極為相似,根據(jù)異質(zhì)樣本的凈電生理特性可以推斷,在0.1%?;悄懰崽幚淼臉颖局写嬖跔I養(yǎng)體艱難梭菌亞群,這與傳統(tǒng)法分析(圖2a和b)的評估結(jié)果一致,但檢測可在更短時間內(nèi)進(jìn)行(4小時.VS >15小時)。

圖322022802.jpg

圖3 營養(yǎng)體艱難梭菌細(xì)胞和孢子的多殼層介電模型&均質(zhì)種群的歸一化DEP光譜

圖3(a) 基于營養(yǎng)體細(xì)胞和孢子的大小、形狀和結(jié)構(gòu)差異,生成多殼層介電模型;(b) 營養(yǎng)體細(xì)胞和孢子均質(zhì)種群的歸一化DEP光譜結(jié)果表明,不同樣品類型的極化和電生理特性存在明顯差異。低于100 kHz的電場頻率下,營養(yǎng)體艱難梭菌細(xì)胞因絕緣細(xì)胞外殼表現(xiàn)為nDEP(負(fù)DEP),但在高于1 MHz的電場頻率下,營養(yǎng)體艱難梭菌因細(xì)胞內(nèi)部的導(dǎo)電細(xì)胞質(zhì)而發(fā)生極化,表現(xiàn)出pDEP(正DEP)。

圖422022802.jpg

圖4 不同頻率、介質(zhì)電導(dǎo)率下,艱難梭菌活細(xì)胞營養(yǎng)體與熱滅活后的艱難梭菌細(xì)胞的阻抗數(shù)據(jù)(相位-振幅)疊加圖(IFC法)

由于孢子萌發(fā)過程中樣品的異質(zhì)性,研究可利用Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀(IFC法)通過檢測營養(yǎng)體艱難梭菌的電生理學(xué)特征來鑒定孢子萌發(fā),并量化營養(yǎng)體艱難梭菌的比例。圖4為不同頻率(0.5 MHz (a & d)、2 MHz (b & e)、10 MHz (c & f))、不同介質(zhì)導(dǎo)電條件(0.5× PBS(a-c)、1× PBS(d–f) )下,艱難梭菌活細(xì)胞營養(yǎng)體與熱滅活后的艱難梭菌細(xì)胞的阻抗數(shù)據(jù)(相位-振幅)疊加圖。對比可知,0.5× PBS(介質(zhì)電導(dǎo)率為 0.8 S/m),10 MHz 下二者的區(qū)分度最佳,篩選門控可設(shè)于218°相位處(圖4c實線),此時艱難梭菌活細(xì)胞占比>95%。

圖522022802.jpg

圖5 不同?;悄懰猁}水平、不同培養(yǎng)時間下艱難梭菌活細(xì)胞的占比(IFC法:0.5× PBS,10 MHz)

圖5顯示孢子萌發(fā)率隨生長培養(yǎng)基中牛磺膽酸鹽水平以及萌發(fā)時間的增加而增加,其中0.1% ?;悄懰猁}的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4 小時后,孢子萌發(fā)率約為 30%(每50μL 樣品約 250 個營養(yǎng)體艱難梭菌細(xì)胞),而0.05–0.1%?;悄懰猁}的生長培養(yǎng)基中萌發(fā) 5 小時后,孢子的萌發(fā)率可達(dá)80%以上;該測定結(jié)果表明艱難梭菌對培養(yǎng)時間和生長培養(yǎng)基中初級膽汁鹽(?;悄懰猁})比例的變化表現(xiàn)出良好的敏感性。

圖622022802.jpg

圖6 未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)實驗比較(宿主菌體外菌群)

本研究使用從小鼠模型獲得的體外菌群樣品進(jìn)一步驗證了實驗結(jié)果的可靠性。在使用克林霉素進(jìn)行抗生素治療10天后,按照圖1d的步驟進(jìn)行了艱難梭菌孢子萌發(fā)實驗。CFU分析(圖6a)結(jié)果顯示,未經(jīng)處理的菌群的孢子發(fā)芽率明顯較低,而克林霉素處理的菌群培養(yǎng)24小時后,孢子萌發(fā)水平顯著提高(**p<0.01),表明抗生素處理后菌群多樣性的減少可能會提高艱難梭菌的萌發(fā)率,這與此前的研究結(jié)果一致。而使用阻抗流式細(xì)胞儀(IFC法)在培養(yǎng)4小時后即可檢測出未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)率(***p<0.001,圖6b)和孢子數(shù)量(**p<0.01,圖6c)上的顯著差異。這表明與CFU法相比,IFC法具有更高的靈敏性,可以更早檢測出宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異(4h與 24 h)。

綜上所述,Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀(IFC法)可用于識別艱難梭菌營養(yǎng)體,量化宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)率的影響,并在較短時間內(nèi)檢測出宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異。該方法檢測靈敏度高、測量快速、樣品制備簡單,有潛力進(jìn)一步用于CDI臨床測量的基準(zhǔn)測試,調(diào)查抗生素治療下腸道菌群隨時間變化的敏感性差異,并通過初始和復(fù)發(fā)艱難梭菌感染的易感性指導(dǎo)臨床管理決策。

—— 原文 ——

John H. Moore et al. Quantifying bacterial spore germination by single-cell impedance cytometryfor assessment of host microbiota susceptibility to Clostridioides difficileinfection. Biosensors and Bioelectronics, Volume 166, 2020, 112440, ISSN0956-5663.


相關(guān)閱讀:

Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀的應(yīng)用:評估胰腺腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性
Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀(IFC)在真核細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用
Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀在癌細(xì)胞狀態(tài)鑒定中的應(yīng)用

收 藏
欧美精品亚洲精品日韩专区va,亚洲欧美偷国产日韩18p,欧美日韩精品视频欧美一区,91精品伊人久久久大香线蕉91,亚洲国产精品综合久久久网络